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李亦學組合作研發出新一代高精度單堿基編輯工具

作者: 2020-05-19 來源:
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  5月18日,Nature Methods 杂志在线发表了题为“A rationally engineered cytosine base editor retains high on-target activity while reducing both DNA and RNA off-target effects”的研究论文,该研究由中國科學院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉研究组、竞彩堂5分快3李亦学研究组和中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟研究组合作完成。该研究根据蛋白结构预测了脱氨酶ssDNA结合的重要氨基酸,在不影响催化活性的情况下,突变相应的氨基酸(APOBEC1上的ssDNA结构域相应氨基酸),从而得到了显著降低DNA脱靶的CBE突变体。

  CRISPR/Cas9的衍生工具DNA单碱基编辑技术可以在不切断DNA双链的情况下实现单核苷酸的定向突变,为单碱基突变引起的遗传性疾病的治疗带来了希望。因此自2016年首次报道以来受到了广泛的关注。但是2019年,单碱基编辑工具的安全性风险受到了质疑,先是杨辉等研究组(Zuo, E. et al, Science 2019; Jin, S. et al, Science 2019)报道了胞嘧啶单碱基编辑器存在严重的DNA脱靶,接着Keith Joung团队(Grunewald, J. et al, Nature 2019)、David Liu团队(Grünewald, J. et al, BioRxiv 2019)和杨辉团队(Zhou, C. et al, Nature 2019)5又分別報道了胞嘧啶單堿基編輯器和腺嘌呤單堿基編輯器存在大量的RNA脫靶效應。雖然先前的研究中通過引入突變的方式顯著降低了RNA的脫靶,但是胞嘧啶單堿基編輯器的DNA脫靶依然沒有得到解決。

  CBE的脫靶是由脫氨酶産生的。脫氨酶利用自身的ssDNA和RNA結合能力,攜帶Cas9蛋白在基因組或者轉錄組中隨機與ssDNA和RNA結合,並且利用自身催化活性將C突變爲T,從而造成單堿基基因編輯工具基因組和轉錄組範圍內完全隨機無法預測的脫靶效應。對此,研究者通過兩種方式試圖降低CBE的脫靶,第一種是在CBE的脫氨酶APOBEC1上引入突變,以此消除ssDNA和RNA的結合能力。他們一共構建了23個CBE突變體,其中4個突變體不影響基因編輯效率檢測,而後通過DNA和RNA的脫靶檢測後獲得的3個突變體BE3R126E、BE3R132E和YE1-BE3能夠顯著降低DNA和RNA的脫靶SNV。該方法是通過突變APOBEC1上的核酸結合域關鍵位點,改變蛋白構象,破壞結合能力,降低隨機脫靶。另外一種方式是利用來自于人的APOBEC3A蛋白替換APOBEC1蛋白,並在APOBEC3A的ssDNA結合位點引入突變,但是這種方式只能降低RNA的脫靶,而不能降低DNA上的脫靶。因此,本研究即以YE1-BE3爲研究重點。爲了進一步提高YE1-BE3編輯效率,研究者隨後又在突變體基礎上增加標簽和核定位序列(FNLS)。優化後的單堿基編輯工具YE1-BE3-FNLS在保證高保真的情況下,顯著提高了基因編輯效率,從而成爲既安全又高效的新的基因編輯工具。

  该研究结果和David Liu团队今年2月10日发表在Nature Biotechnology的研究结论一致,两篇文章都报道YE1在保持较高的编辑效率的同时降低了DNA和RNA上的脱靶,并且同时縮小了编辑窗口并降低了indel产生的比例。但是David Liu团队基于细菌抗性筛选的方法只适用于CBE,而杨辉团队基于GOTI的方法是不受限制的,不仅可以检测单碱基编辑器,还可以用于其它基于融合蛋白的基因编辑工具的安全性检测和改进。在本研究中杨辉团队使用GOTI和RNA-Seq同时检测了突变体的DNA脱靶和RNA脱靶,并且发现DNA和RNA的脱靶是互相独立的,需要同时检测。他们获得的 YE1-BE3-FNLS是高精度、高活性单碱基编辑工具,显著降低了脱靶效应和提高了编辑效率,有望应用于遗传疾病基因治疗,推动基因编辑临床化应用。

  该项工作由中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟研究员,中科院分子细胞卓越创新中心孙怡迪博士,中国农业科学院深圳农业基因组研究所助理研究员袁堂龙,中國科學院脑科学与智能技术卓越创新中心贺冰冰和周昌阳博士等在中國科學院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉研究员, 竞彩堂5分快3李亦学研究员和中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟研究员指导下完成。(科技处)

  原文鏈接:https://www.nature.com/articles/s41592-020-0832-x


圖:經典的BE3單堿基編輯工具APOBEC1脫氨酶具有ssDNA結合區域BD和催化活性區域AD(左側圖)。YE1-BE3-FNLS單堿基編輯工具APOBEC1脫氨酶丟失了ssDNA結合區域BD保留了催化活性區域AD(右側圖)。

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